1、光遺傳學(optogenetics)技術

1.1 光遺傳學技術 腦科學研究工具的基本功能是記錄神經(jīng)元的活動與調(diào)控。隨著成像技術的發(fā)展，神經(jīng)活動記錄目前已經(jīng)實現(xiàn)了從宏觀記錄到微觀記錄的演變，功能磁共振成像 (functional MRI，fMRI)、正電子成像 (positron emission tomography， PET)、腦電圖 (electroencephalography，EEG)、神經(jīng)元鈣成像技術 (calcium imaging) 等可以在不同微觀層面上顯示神經(jīng)元活動，單光子及雙光子顯微鏡的出現(xiàn)使得對神經(jīng)元的觀察可以細致到單個神經(jīng)元甚至是細胞亞結構如突觸水平。在神經(jīng)元調(diào)控層面， 傳統(tǒng)的調(diào)控方式包括細胞外電生理刺激、藥物干預和基因編輯，等。電刺激是Z常用的神經(jīng)元調(diào)控手段， 具有較高的時間準確性，但細胞特異性低。其他方式如藥物干預或者基因編輯，可以精que到特殊類型細胞，但時間分辨率較低。因此，早期的腦功能研究工具尚不能兼顧高時間分辨率、高空間分辨率和細胞類型高分辨率。理想的腦科學研究工具需要兼顧這 3 種分辨率需求，特別是目前對于腦功能連接網(wǎng)絡的研究，急需單個神經(jīng)元和神經(jīng)纖維分辨率下的神經(jīng)元群體的長期調(diào)控與觀察，這就需要突破現(xiàn)有腦功能研究工具的技術瓶頸。

光遺傳學是將遺傳學與光學相結合的新技術，使用遺傳學手段，常以病毒或者使用轉(zhuǎn)基因動物為載體， 將光敏蛋白基因?qū)氲侥繕思毎校毎磉_光敏感蛋白，之后利用光學調(diào)控細胞活動，光遺傳學的本質(zhì)是將遺傳學與光學方法相結合從而使活體中特定細胞獲得或失去特定的功能。

光遺傳學的應用與發(fā)展實現(xiàn)了神經(jīng)科學家用光照控制神經(jīng)元活動的設想，結合成像等輔助技術， 具有高時間特異性、高空間特異性以及高細胞類型特異性進行神經(jīng)元調(diào)控的特性，從各個層面上進行腦科學研究 。

1.2 光遺傳學技術的原理與應用方法   光遺傳學技術是遺傳學與光學技術的結合，利用遺傳學手段， 將光敏感蛋白導入至目標細胞中，之后利用光學手段刺激目標細胞從而實現(xiàn)細胞功能的控制。光遺傳學技術的 6個簡要步驟。

首先是在目標神經(jīng)元中表達光敏蛋白 —— 視蛋白。視蛋白是光遺傳學中使用z廣泛的執(zhí)行元件， 是光敏感膜蛋白在受到特定頻率的光線照射后可以實現(xiàn)暫時的構象變化、執(zhí)行功能。根據(jù)視蛋白種類的不同，可以實現(xiàn)神經(jīng)元的激活或者抑制。實現(xiàn)光敏蛋白在目標細胞的表達：

①構建遺傳學元件。

② 選用合適的載體將遺傳學元件導入目的細胞進行基因改造，常用由病毒、轉(zhuǎn)基因動物或者兩者相結合的方式來實現(xiàn)的。轉(zhuǎn)基因動物結合病毒載體注射的方式可以更好的實現(xiàn)光敏蛋白表達的細胞類型與空間特異性，是目前z廣泛使用的方法，比如 Cre 重組酶小鼠結合病毒載體導入。

③將構建好的病毒載體注射到目的腦區(qū)使其在目標神經(jīng)元表達。這些基因產(chǎn)物感應光照后，產(chǎn)生相應的構象改變，作為光敏感離子通道或離子泵等工作元件而發(fā)揮作用，發(fā)揮蛋白功能、調(diào)控細胞活動 。

④光源調(diào)控元件植入目標部位。常用的“光電極”是光纖結合電極將光源的傳遞與電生理記錄整合到一個裝置中，從而實現(xiàn)在使用光源控制神經(jīng)元活動的同時進行神經(jīng)活動的電生理記錄。

⑤選擇特定波長的光源進行目標細胞的活動干預，常用的光源有激光、發(fā)光二極管 (light-emitting diodes，LED)。激光光源優(yōu)勢在于可以使用波段較短的光，實現(xiàn)不同類型視蛋白的控制，并且可以與光纖有效結合，便于腦深部的光源導入，腦損傷較小。LED 優(yōu)勢在于價錢更低，以及具有較多的光源顏色的選擇，可以實現(xiàn)多位點發(fā)光以及制作成無線移動裝置 。⑥實驗過程中輸出數(shù)據(jù)的讀取與分析，涉及到光遺傳學各種輔助技術的快速發(fā)展。

摘要 光遺傳學廣義上是借助光感靶向控制工具向效應細胞傳遞不同功能的研究工具。在神經(jīng)科學研究中，科學家可以利用光學手段調(diào)控特定神經(jīng)元亞群(甚至單個神經(jīng)元)的電活動，研究生理和病理情況下神經(jīng)環(huán)路的功能和潛在調(diào)控機制。光遺傳結合鈣離子成像技術，可以在生理調(diào)控的基礎上實現(xiàn)實時觀測神經(jīng)元的響應活動，有助于從多個維度定位特定功能的神經(jīng)元集群，進一步揭示其在神經(jīng)環(huán)路中的具體作用，用于解釋腦疾病對整體腦功能網(wǎng)絡的影響，幫助臨床醫(yī)生更好地理解帕金森病、阿爾茨海默病、癲 等神經(jīng)環(huán)路疾病的發(fā)病機制，找到潛在的治療靶點，改善患者的臨床預后。

光遺傳學技術可以與多種數(shù)據(jù)讀取方式相結合。電生理信號的讀取是Z常用的方式之一，如光電極， 可以在自由活動動物身上實現(xiàn)多個位點的電生理記錄，具有較高的時間與空間分辨率，但是細胞類型分辨率較低。采用fMRI 可以從宏觀上對于腦功能的變化進行提示，也是數(shù)據(jù)讀取方式之一，但其時間、空間、細胞類型分辨率都較低。光學信號讀取具有更好的空間分辨率以及細胞類型信息。基于染料的成像已經(jīng)用于各種光遺傳學研究，使用鈣離子染料、電壓敏感染料可以實現(xiàn)神經(jīng)元活動的可視化 。神經(jīng)元鈣成像是近年來快速發(fā)展的光遺傳學數(shù)據(jù)讀取的有效方式。

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